亚洲成av人片在线观看无码,亚洲国产精华液网站w,亚洲日韩av无码精品放毛片,天天躁日日躁狠狠躁av麻豆

主營(yíng)產(chǎn)品:

ELISA試劑盒,人ELISA試劑盒,大鼠ELISA試劑盒,小鼠ELISA試劑盒,裸鼠ELISA試劑盒,倉(cāng)鼠ELISA試劑盒,標(biāo)準(zhǔn)品,培養(yǎng)基和生物試劑等

18221656311

聯(lián)系我們/CONTACT US

聯(lián)系人:錢經(jīng)理

電 話:18221656311

手 機(jī):18221656311

地 址:上海市松江臨港科技城漢橋文化科技園B座

郵 編:200093

傳 真:021-64881400

郵 箱:2885617636@qq.com

阿儀網(wǎng)商鋪:http://www.app17.com/c58469/

手機(jī)網(wǎng)站:m.hybiosh.com

產(chǎn)品分類/CLASS

ELISA試劑盒

酶聯(lián)免疫試劑盒

人ELISA試劑盒

進(jìn)口血清

抗體

標(biāo)準(zhǔn)品

Sigma試劑

Amresco試劑

食品檢測(cè)試劑盒

Spectrum試劑

免疫化學(xué)產(chǎn)品

其他方法測(cè)試盒

金標(biāo)試劑盒

放免試劑盒

代理品牌

技術(shù)文章ARTICLE

恒遠(yuǎn):免疫共沉淀與Western Blot

點(diǎn)擊次數(shù):13725   發(fā)布時(shí)間:2012/9/4 11:11:28

免疫共沉淀與Western Blot
實(shí)驗(yàn)步驟:
1.以60mm 細(xì)胞培養(yǎng)皿為例,細(xì)胞轉(zhuǎn)染后24-36 小時(shí)后,吸凈培養(yǎng)液(可用PBS
小心漂洗一次)。
2.加入500μl 預(yù)冷的1×lysis buffer, 于4℃或冰上放置裂解細(xì)胞5 分鐘。
3.將細(xì)胞裂解液轉(zhuǎn)移到1.5 ml eppondorf 管內(nèi),于冷凍離心機(jī)4℃,13000 g 離心30
分鐘。
4.將離心后的上清液分為兩份:一份35μl,加入等體積的2×SDS sample buffer, 混
勻后于100℃煮10 分鐘,做為總細(xì)胞裂解液(total cell lysate,TCL)于-20℃
保存,或取6-10 μl 進(jìn)行SDS-PAGE 電泳,Western blot 檢測(cè)目的蛋白的表達(dá)
水平(接第5 步)。另一份用于免疫沉淀,具體操作如下:
1) 分A/G beads:按每管(一個(gè)免疫沉淀樣品)加入5 μl Agrose A/G beads
及5 μl(1 μg)抗體計(jì)算一次實(shí)驗(yàn)所用beads 及抗體的總量,將抗體和beads 混
合,補(bǔ)充lysis buffer (補(bǔ)充的lysis buffer 的量能使每管能均勻分配到50 μl beads
及抗體的混合物),將beads 及抗體的混合物按每管50 μ(l 含5 μl beads 及5 μl 抗
體)分配到1.5 ml Eppendorf 管中,再加入400 μl 1×lysis buffer,備用;
2) 從步驟4 中另一份用于免疫沉淀的上清液中取400 μl 加入到上一步(步驟
1))已分好的beads 中,使終體積達(dá)到850 μl,將管子固定到混勻器上使混勻器
勻速旋轉(zhuǎn)(15 rpm)免疫沉淀3 小時(shí);
3) 將免疫沉淀后的溶液于4℃ 3000 rpm 離心3 分鐘,去上清,加入500μl
1×lysis buffer 洗滌beads,于冷凍離心機(jī)4℃ 3000 rpm 離心3 分鐘,棄上清,共
洗滌三次。
4)*后一次洗滌完畢,棄上清,管中只剩Beads,加入35 μl 1×lysis buffer 與
等體積2×SDS sample buffer 混合,于100℃煮沸10 分鐘,稍離心后取10μl 左右
上樣到PAGE 膠,進(jìn)行電泳,或-20℃凍存。
5.電泳完畢,取下PAGE 膠,與PVDF 膜做成"三明治"形狀,用濕轉(zhuǎn)法進(jìn)行電轉(zhuǎn)1
小時(shí)。
6.電轉(zhuǎn)完畢,取下PVDF 膜,加入5%脫脂奶粉,于脫色搖床搖蕩(75 rpm)封閉
1 小時(shí)以消除非特異背景。
7. 封閉完畢,用TBST 洗掉牛奶,加入一抗,于脫色搖床搖蕩孵育(75 rpm)1
小時(shí),使一抗與特異蛋白結(jié)合。
8. 回收一抗,用TBST 洗3 次(75 rpm),每次5-10 分鐘。
9. 加入二抗,于脫色搖床孵育1 小時(shí),使二抗與一抗結(jié)合。
10.用TBST 洗3 次,每次5-10 分鐘。
11.將ECL A 液和ECLB 液各1ml,混勻,放入二抗孵育后的PVDF 膜30 秒,將
PVDF 膜平鋪于曝光盒中,進(jìn)暗房,用醫(yī)學(xué)X 光膠片曝光。
12.經(jīng)過顯影、定影后的膠片,于室溫下自然風(fēng)干或烘干,描畫蛋白marker 便于分
析。
注:如只做Western Blot,跳過步驟4 即可。
實(shí)驗(yàn)試劑:
1.PBS:
NaCl 20mM, KCL 2.68mM, Na2HPO410mM, KH2PO4 1.76mM (pH7.4),室溫保
存。
2.1×lysis buffer:
Tris-HCl 20 mmol/L(pH7.5), NaCl 150 mM, EDTA 1 mM, EGTA 1 mM, Triton
X-100 1%, Sodium pyrophosphate 2.5 mM, β-Glycerrophosphate 1 mM, NaVO4
1 mM, Leupeptin 1 ug/ml,-20℃保存。(稀釋成1×lysis buffer 后加入1 mM
PMSF )
3.2×SDS sample buffer:
Tris-Cl(pH 6.8)125 mM,SDS 4%,甘油20%,DTT 100 mM,溴酚蘭0.02%,
室溫保存。
4.分離膠(下層膠)(10% SDS-PAGE)15 ml:
30% 丙烯酰胺5 ml,10×lower buffer (pH 8.8) 1.5 ml,H2O 8.5 ml,10% AP 15
μl,TEMED 15 μl。
5.10 × lower buffer (pH 8.8) 100 ml:
42.25 g Tris base,10 ml 10%SDS,室溫保存。
6.壓縮膠(上層膠)(4 % SDS-PAGE)5 ml:
30% 丙烯酰胺0.65 ml,4×stacking buffer (pH 6.8) 1.25 ml,H2O 3.05 ml,10%
AP 5 μl,TEMED 5 μl。
7.4 × stacking buffer (pH 6.8) 100 ml:
6.06 Tris base,4 ml 10%SDS,室溫保存。
8.電泳緩沖液:
Tris base 0.125 M,甘氨酸0.96 mM,SDS 0.5%,室溫保存。
9.電轉(zhuǎn)緩沖液:
Tris 25 mM,甘氨酸0.2 mM,甲醇10%,室溫保存。
10.10×TBS (pH 7.6):
Tris base 2.42%,NaCl 8%,室溫保存。
11.TBST:
1×TBS,Tween-20 0.1%,室溫保存

  上海恒遠(yuǎn)生物科技有限公司是中國(guó)大陸家專業(yè)經(jīng)營(yíng)ELISA試劑盒,與國(guó)內(nèi)眾多的大型企業(yè),醫(yī)院,學(xué)校,科研單位合作,也是眾多單位的指定產(chǎn)品供應(yīng)商,為了迎接國(guó)慶和中秋節(jié)從即日起,產(chǎn)品一律八折出售,我們公司主要經(jīng)營(yíng)的產(chǎn)品有ELISA試劑盒生物試劑,血清標(biāo)準(zhǔn)品,培養(yǎng)基,歡迎各位前來咨詢和購(gòu)買。

 

原創(chuàng)作者:上海恒遠(yuǎn)生物科技有限公司

TOP

掃一掃,關(guān)注我們!

首 頁(yè)| 公司介紹| 產(chǎn)品展示| 公司新聞| 技術(shù)文章| 聯(lián)系我們| 客戶留言

阿儀網(wǎng) 設(shè)計(jì)制作,未經(jīng)允許翻錄必究. 聯(lián)系人:錢經(jīng)理 聯(lián)系電話:18221656311 ICP備案號(hào):滬ICP備11004148號(hào)-11 總訪問量:7897986 管理登錄

主營(yíng)產(chǎn)品:ELISA試劑盒,人ELISA試劑盒,大鼠ELISA試劑盒,小鼠ELISA試劑盒,裸鼠ELISA試劑盒,倉(cāng)鼠ELISA試劑盒,標(biāo)準(zhǔn)品,培養(yǎng)基和生物試劑等

14

阿儀網(wǎng)推薦收藏該企業(yè)網(wǎng)站

聯(lián)系方式

18221656311
13296034073

工作時(shí)間

(9:00-18:00)
色偷偷人人澡久久超碰97位| 黑人强开嫩模又小又紧| 国产亚洲精品aaaa片小说| 国产伦精品一区二区三区免费| 国模无码视频一区二区三区| 双天至尊第一部| 国产午夜av无码无片久久96| 伸进内衣揉捏她的乳尖视频| 全职法师第6季全集免费观看| 日本真人做爰免费视频120秒| 末成年女a片一区二区| 野花视频在线观看免费| 一女被二男吃奶a片免费观看| 农村穷山沟女人乱弄视频| 欧美裸体xxxx极品少妇| 久久久综合香蕉尹人综合网| www国产精品内射老熟女| 掀起裙子扶着巨物坐下去| av在线观看| 欧美性情免费观看| 丰满少妇被猛烈进入a片| 久久亚洲av成人无码国产| 宝贝∽好硬∽好爽一再...| 高潮vpswindows国产乱| 邻居少妇太爽了a片在线观看动漫| 白少洁第1一40章免费阅读| 亚洲av午夜福利精品香蕉麻豆| 手机电影在线观看| 国产欧美久久一区二区三区| 黄海川邱舒涵全文免费阅读| 精品人妻一区二区三区浪潮在线| 大战熟女丰满人妻av| 国务院发展研究中心主任| 太粗大进不去倒刺带钩| 特黄特色大片免费播放器下载| 精品国产产一区二区三区久久| 成色au999| 法国艳妇laralatex| 性色av浪潮av色欲av一区| 色欲色香天天天综合www| 掀起裙子扶着巨物坐下去|