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質粒轉化實驗操作步驟

點擊次數(shù):45   發(fā)布時間:2024/10/15 11:15:42

1.基本原理 

將質粒 DNA 導入細菌的過程稱為轉化( Transformation )。此感受態(tài)細菌細胞在 CaCl 2 低滲溶液中膨脹為球狀。質粒 DNA 與 CaCl 2 形成抗 DNase 羥基 - 磷酸鈣復合物黏附于細菌表面,經(jīng) 42℃ 短時間熱沖擊處理,促進細胞吸收 DNA 復合物。在豐富培養(yǎng)基上生長數(shù)小時后,球狀細胞復原并分裂增殖。被轉化的細菌中,外源基因得到表達。在選擇性培養(yǎng)平板上,可選出所需的轉化子(即含有質粒 DNA 的細菌)。鈣處理的感受態(tài)細胞,一般每微克 DNA 能獲得 10 5 ~ 10 6 個轉化子。除化學方法轉化細菌外,還有電穿孔法( Electroporation ),其轉化率可高達 10 9 ~ 10 10 個轉化子 /μg 質粒 DNA 。

 

2.器材 

①培養(yǎng)皿  ②恒溫培養(yǎng)箱

 

3.試劑 

① LB 培養(yǎng)基

②選擇性 LB 瓊脂培養(yǎng)平板(含氨芐青霉素,終濃度為 50μg/ml )

③氨芐青霉素 100 mg/ml

④宿主細菌:經(jīng) 100 mmol/L CaCl 2 處理的感受態(tài)細菌 DH5α

 

4.操作步驟 

①取 50 μL 大腸桿菌感受態(tài)細胞,加入適量質粒(體積不得超過 4 μL )冰浴 30 min 后, 42℃ 熱激 90 s ,馬上放回冰上,冰浴 2 min ;

②加 400 μL LB 培養(yǎng)基,于 37℃ 搖床慢搖振蕩培養(yǎng) 45-60 min ;

③取 50-100 μL 涂在含有氨芐青霉素( 100 μg/mL )的 LB 固體培養(yǎng)基上, 37℃ 倒置培養(yǎng)過夜。

 

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